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实习医生日记之顽固失眠

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实习医生日记之猪蹄脚

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组成 黄芪10克,党参(或太子参)10克,丹参10克,炒白术10克,薏苡仁15克,仙鹤草15克,白花蛇舌草15克,甘草5克。功能 益气活血,健运脾胃。主治 适用于治疗慢性萎缩性胃炎,或伴有肠上皮化生等

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2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读

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摘要:年月日生物谷时光总是匆匆而逝月份即将结束年也接近尾声迎接我们的将是崭新的年年科学家们在研究领域依然取得了许多重磅级的研究成果本文中小编对年研究领域的重磅级亮点研究进行盘点分享给大家与各位一起学习重磅在哺乳动物体内利用改造的治疗糖尿病
2017年12月31日/生物谷BIOON/---时光总是匆匆而逝,12月份即将结束,2017年也接近尾声,迎接我们的将是崭新的2018年,2017年科学家们在CRISPR/Cas研究领域依然取得了许多重磅级的研究成果,本文中小编对2017年CRISPR/Cas研究领域的重磅级亮点研究进行盘点,分享给大家!与各位一起学习!

1.Cell:重磅!在哺乳动物体内利用改造的CRISPR/Cas9治疗糖尿病、急性肾病和肌肉萎缩症
doi:10.1016/j.cell.2017.10.025
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读 图片来自Salk Institute。
在一项新的研究中,来自美国沙克生物研究所的研究人员开发出CRISPR/Cas9基因组编辑技术的一种新版本,从而允许他们激活靶基因,同时不会导致DNA断裂,这就潜在地克服了利用基因编辑技术治疗人类疾病的一个重大的障碍。相关研究结果于2017年12月7日在线发表在Cell期刊上,论文标题为“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”。

在初始的CRISPR/Cas9系统中,酶Cas9与指导它靶向到基因组中合适位点上的向导RNA(gRNA)结合在一起,从而在DNA上产生双链断裂。近期,一些人开始使用Cas9的“死亡”形式(即dCas9):仍然能够靶向基因组中的特定位点,但是不再切割DNA。相反,dCas9与激活靶基因的转录激活结构域(transcriptional activation domain, TAD,起着分子开关的作用)结合在一起。但是由此产生的蛋白---dCas9-TAD---块头太大而不适合被包装到通常用于运送编码这些蛋白的基因到活体细胞内的腺相关病毒(AAV)载体中。缺乏一种高效的运送系统使得很难在临床应用中使用这种工具。

为了验证这种方法,这些研究人员使用了急性肾损伤、1型糖尿病和一种肌肉萎缩症的小鼠模型。在每种小鼠模型中,他们设计出他们的CRISPR/Cas9系统来增强可能潜在地逆转疾病症状的内源性基因的表达。就急性肾病而言,他们激活两个已知参与肾脏功能的基因,并观察到不仅这些基因表达的蛋白水平发生增加,而且这会改善急性肾脏损伤发生之后的肾脏功能。就1型糖尿病而言,他们旨在增强能够产生β细胞(即一种分泌胰岛素的细胞)的基因的活性。这种新方法又一次发挥作用,成功地降低1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。就肌肉萎缩症而言,他们让之前已经证实逆转疾病症状的基因表达,包括不能够很容易地通过传统的病毒介导的基因疗法加以运送的一个特别大的基因。

2.PNAS:重大进展!制定出利用CRISPR/Cas9高效编辑基因组规则
doi:10.1073/pnas.1711979114

科学家们普遍认为,细胞通过随机地插入一组核苷酸来修复CRISPR/Cas9系统诱导的DNA断裂。这通常会破坏任何位于发生断裂的DNA位点处的基因。科学家们已知细胞有时利用供者DNA来修复细胞基因组中的断裂。然而,这种供者DNA序列本身不会自我插入到细胞基因组中的空白位点上。相反,这种供者DNA的每个末端都存在着一种同源臂(homology arm)以便封闭这种切割造成的空隙。

在一项新的研究中,来自美国约翰霍普金斯大学的研究人员将不同的供者DNA组合插入到人胚胎肾细胞中,这些细胞以其生长良好的能力和经常用于癌症研究中而为人所知。他们使用携带着编码一种绿色荧光蛋白的基因的供者DNA,当这种基因成功地插入到细胞基因组中时,这种绿色荧光蛋白就会在细胞的核膜上发出绿色荧光。相关研究结果于2017年11月27日在线发表在PNAS期刊上,论文标题为“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。

具体而言,这些研究人员发现长度为33~38nt的同源臂与长度为518nt的同源臂具有相同的编辑成功率,在最佳条件下产生10%~20%的编辑成功率。相反之下,当他们利用长度为15~16nt的同源臂进行测试时,这种基因插入成功率下降了一半。他们在人基因组的三个不同的位点上重复了这些结果。他们还发现新插入的DNA序列能够长达1000nt(不包括同源臂)。

这些研究人员利用长度为57~993nt的供者DNA序列取得的编辑成功率在10%~50%。更短的供者DNA要比更长的供者DNA取得更高的编辑成功率。比如,长57nt的供者DNA、长714nt的供者DNA和长993nt的供者DNA插入到细胞基因组靶位点上的成功率分别为45.5%、23.5%和17.9%。当长度超过1000nt时,长1122nt的供者DNA和长2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大约为0.5%。

3.Nature:利用CRISPR/Cas9让小鼠恢复听力
doi:10.1038/nature25164

Tmc1基因是内耳中检测声波的毛细胞发挥正常功能所必需的。携带着Tmc1基因的某种显性突变的人和小鼠经历着渐进性听力丧失。在一项新的研究中,研究人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑策略让这个基因的突变版本失活,从而降低贝多芬小鼠模型中的这种听力丧失。相关研究结果于2017年12月20日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents”。

在这项新的研究中,美国哈佛大学化学生物学家David Liu和同事们设计出一种向导RNA(gRNA)来特异性地靶向这个基因的常染色体显性的致病性拷贝。他们不是利用一种基于病毒的系统来运送Cas9和gRNA序列,而是将以一种被称作Cas9-gRNA复合体的核糖核蛋白(ribonucleotide protein, RNP)封装在脂质中并进行运送。这种策略改善了这种突变等位基因的编辑选择性,因此相比于小鼠成纤维细胞培养物中的野生型等位基因,它靶向这种突变等位基因的频率增加了20倍。

接下来,这些研究人员将脂质包装的RNP复合体注射到新生的贝多芬小鼠模型(具有一个突变等位基因和一个野生型等位基因)的一只内耳中,并留下一只未接受注射的内耳作为内部对照。这些接受注射的耳朵具有完整的健康的毛细胞,但是未接受注射的耳朵到八周时具有快速的毛细胞死亡。Liu说,“这是激动人心的,这是因为这提示着相比于未接受注射的耳朵,我们能够让接受注射的耳朵保持毛细胞健康和丰度。”

这些研究人员通过监控听觉脑干反应(auditory brainstem response, ABR)来测试四周大的贝多芬小鼠模型的听力。ABR用于衡量神经元对声音的反应。未接受注射的耳朵记录了75~80分贝左右的ABR,与垃圾处理的噪音音量相当。接受注射的耳朵能够听到安静的大约60分贝的声音,这相当于安静的谈话。尽管这是一种进步,但是野生小鼠能够听到低至30~40分贝的声音,这提示着CRISPR基因组编辑部分上避免了听力丧失。到8周时,接受注射的耳朵的ABR阈值仍然低于未接受注射的耳朵,但是要高于4周时的ABR阈值,这提示着这些小鼠的听力继续恶化。对响亮声音作出的行为反应在这些接受治疗的小鼠和野生小鼠之间遵循着类似的模式。

4.Science:重大突破!利用细菌CRISPR/Cas系统构建出世界上最小的磁带录音机
doi:10.1126/science.aao0958
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读 图片来自Wang Lab/Columbia University Medical Center。
在一项新的研究中,来自美国哥伦比亚大学医学中心的研究人员通过一些巧妙的分子黑客技术,将一种天然的细菌免疫系统转化为一种微型数据记录器,从而为开发将细菌细胞用于疾病诊断和环境监测等用途的新技术奠定基础。相关研究结果于2017年11月23日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Multiplex recording of cellular events over time on CRISPR biological tape”。

这些研究人员对人体肠道中普遍存在的大肠杆菌的一种普通的实验室菌株进行基因修饰,使得它们不仅记录与它们与环境之间的相互作用,而且还记录这些事件发生的时间。

论文通信作者、哥伦比亚大学医学中心病理学、细胞生物学与系统生物学系助理教授Harris Wang说,“这些被病人吞下的细菌可能能够记录它们在整个消化道中经历的变化,从而对之前无法观察到的现象产生前所未有的认识。”其他的应用可能包括环境监测,生态学和微生物学领域的基础研究。

Wang和他的同事们利用很多细菌物种中存在的一种免疫系统---CRISPR-Cas---来构建这种微型数据记录器。CRISPR-Cas系统复制来自入侵病毒的DNA片段,因此随后的细菌后代能够更加有效地抵抗这些病原体。结果就是细菌基因组中的CRISPR位点按时间顺序记录着在病毒感染中存活下来的细菌和它的祖先遭遇到的病毒感染。当这些相同的病毒试图再次感染时,这种CRISPR-Cas系统能够识别和消除它们。

5.Nat Biotechnol:重磅!科学家开发出能携带CRISPR系统的新型纳米颗粒 可实现对细胞基因组的精准编辑
doi:10.1038/nbt.4005

近日,刊登在国际著名杂志Nature Biotechnology上的一篇研究报告中,来自MIT的科学家开发出了一种新型纳米颗粒,这种纳米颗粒能够运输CRISPR基因编辑系统,并对小鼠机体的基因进行特异性修饰;因此研究人员就能够利用纳米颗粒来携带CRISPR组分,从而就消除了使用病毒的需要。

利用这种新型的运输技术,研究者就能对大约80%的肝脏细胞进行特定基因的切割,这或许就能达到目前在成体动物中应用CRISPR技术的最佳成功率。 研究者Daniel Anderson教授说道,让我们非常激动的是,我们制造了这种特殊的纳米颗粒,其能被用来永久特异性地编辑成年动物机体肝细胞中的DNA;本文研究中,研究者所研究的一种名为Pcsk9的基因能调节机体胆固醇的水平,而人类机体中该基因的突变或许和一种名为家族性高胆固醇血症的罕见疾病有关,目前FDA批准的两种抗体药物能够抑制Pcsk9基因的表达,然而这些抗体药物需要在患者后半生中定期服用,而新型的纳米技术或能永久性地对该基因进行编辑,同时就为治疗这种罕见疾病提供了新的治疗思路。

6.Science:重磅!CRISPR/Cas9为寻找靶DNA序列的灵活性付出时间代价
doi:10.1126/science.aah7084

在一项新的研究中,来自瑞典乌普萨拉大学的一个研究小组发现被称为“分子剪刀(molecular scissors)”的CRISPR-Cas9如何能够在基因组中寻找特定的DNA序列。Cas9已经在生物技术领域有了很多应用,也有望给医学带来革命性的变化。这些研究发现表明如何改进Cas9使得这种分子剪刀变得更加快速和更加可靠。相关研究结果发表在2017年9月29日的Science期刊上,论文标题为“Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli”。

这些研究人员开发出两种新的方法来测量Cas9找到它的靶序列需要多长时间。第一种方法表明Cas9花6个小时的时间搜索细菌基因组(400万个碱基对)。这种有点不可能的结果也能够通过第二种独立的方法加以验证。所发现的这种时间也与Cas9用来测量每个位点花费的毫秒数(能够通过实时地追踪标记的Cas9分子加以测量)相吻合。

Elf说,“这些结果表明Cas9为它的灵活性付出的代价是时间。为了更快速地发现靶序列,需要更多的Cas9分子寻找相同的DNA序列。”

7.Nature:操纵Cas9的REC3结构域可大幅降低CRISPR-Cas9的脱靶效应
doi:10.1038/nature24268
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读
图片来自Janet Iwasa graphic for Doudna Lab。
在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校、麻省总医院、哈佛医学院和劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员鉴定出Cas9蛋白中的一个关键区域决定着CRISPR-Cas9如何精准地对靶DNA序列进行编辑,对它进行微调可产生超精准的基因编辑器,并且使得该基因编辑器的脱靶切割(off-target cutting)活性降低到有史以来的最低水平。相关研究结果于2017年9月20日在线发表在Nature期刊上,论文标题为"Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy"。论文通信作者为加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授、霍华德-休斯医学研究所研究员Jennifer Doudna博士。

在CRISPR-Cas9中,Cas9蛋白起着结合和切割DNA的作用。这些研究人员说,他们鉴定出的这种蛋白区域作为DNA切割的一种主控制器发挥作用,是对Cas9进行重新设计进一步提高它的切割精准度的一种显而易见的靶标。这种方法应当有助科学家们定制设计Cas9变异体,从而使得CRISPR-Cas9在错误位点上对DNA进行编辑的几率最小化。当利用CRISPR-Cas9在人体进行基因治疗时,这是一个关键的考虑因素。

在当前的这项研究中,Chen和Dagdas利用一种被称作单分子荧光共振能量转移(single-molecule FRET, smFRET)的技术准确地测量当Cas9-sgRNA复合物结合到靶DNA上时,这种复合物中的多种蛋白结构域,特别是REC3、REC2和HNH结构域,如何移动。

他们首先确定了eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1提供的特异性益处能够根据这些Cas9变体中的HNH构象开关的激活阈值要比野生型Cas9蛋白高得多从而使得当结合到脱靶序列上时eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1变体更不可能激活Cas9的切割活性的事实加以解释。

接着,他们发现REC3结构域负责检测靶标结合的精准度,随后这会指示REC2结构域向外旋转而为HNH核酸酶结构域打开一条通路,从而激活Cas9的切割活性。具有这种活性构象的Cas9随后能够切割靶DNA的双链。

Chen、Dagdas和Kleinstiver随后证实通过让REC3的部分片段发生突变,就有可能改变Cas9蛋白的特异性,使得HNH核酸酶结构域不会被激活,除非这种sgRNA与靶DNA非常严格地匹配。他们能够设计出一种改进的超精准的Cas9(被称作HypaCas9),这种HypaCas9保留了它的在靶切割效率,但略微更好地区分人细胞中的在靶位点和脱靶位点。

8.Cell:重大突破!发现一种广谱的CRISPR/Cas9抑制剂
doi:10.1016/j.cell.2017.07.037

在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校、马萨诸塞大学医学院、哈佛医学院和加拿大多伦多大学的研究人员证实两种Acr蛋白,即AcrIIC1和AcrIIC3,利用不同的策略抑制Cas9。相关研究结果发表在2017年9月7日的Cell期刊上,论文标题为"A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9"。

AcrIIC1是一种广谱Cas9抑制剂,通过直接结合到Cas9的保守性HNH催化结构域上,阻止多种有差异的Cas9直系同源物切割DNA。AcrIIC1-Cas9 HNH结构域复合体的晶体结构展示了AcrIIC1如何将Cas9限制在一种DNA结合的但是没有催化活性的状态。相反,AcrIIC3阻断单个Cas9直系同源物的活性,诱导Cas9形成二聚体,从而阻止Cas9结合到靶DNA上。

这两种不同的机制允许独自地控制Cas9的靶标DNA结合和切割,而且也为开展允许Cas9结合到靶DNA上但阻止它切割DNA的应用铺平道路。

9.Nature:"基因剪刀"-CRISPR-Cas9变"钝"为自体免疫病研究提供新启示
doi:10.1038/nature23875

如今,来自加利福尼亚大学的研究者们利用修饰后的CRISPR系统寻找增强子,这一更新后的工具并不具有基因编辑能力,相反地,它能够精确地定位增强子存在的区域。根据最近发表在《nature》杂志上的相关结果,来自UCSF的研究者们利用这种叫做CRISPR activation (CRISPRa)的工具成功地找到了调控免疫细胞发育的增强子。这段序列对于自体免疫疾病的发生具有重要的作用。

来自USCF的Jonathan Weissman教授等人开发出的这种叫做"CRISPRa"的技术则能够对增强子进行精确地激活。与传统的CRISPR-CAS9技术不同,CRISPRa利用修饰后的Cas9酶与CRISPR联合使用,能够在找到特定DNA序列之后进行靶向激活,而非切割。该技术最早是应用于寻找启动子区域,而这一次研究者们则试图寻找增强子区域。

具体地,研究者们研究的是一种编码"IL2RA"的蛋白的基因。该蛋白对于T细胞的功能具有重要的作用。IL-2RA能够决定T细胞启动炎症反应或进行免疫抑制。如果该基因的增强子区域出现故障,那么细胞将难以起到抑制炎症反应的能力,从而导致自体免疫疾病的发生。

通过对IL2RA上游的DNA序列进行连续筛选,作者发现一段序列对于调控IL2RA的产生具有重要的作用,并最终证明其为IL2RA基因的增强子。

10.Nature:重磅!利用CRISPR–Cas9成功校正人胚胎中的致病性突变
doi:10.1038/nature23305
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读
图片来自Nature期刊。
近日,关于一个科学家小组首次在美国对活的人胚胎进行基因编辑的消息传开了。不过,这一成就的细节在当时是粗略的。如今,他们在线发表了他们的结果,揭示出他们成功地校正导致心脏病的MYBPC3基因突变。相关研究结果于2017年8月2日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos”。

美国哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所遗传学家George Church(未参与这项研究)告诉《科学家》杂志,“这是一个非常重大的里程碑。人们对美国丧失它的优势感到焦虑不安,这是因为中国正在取得进展。但是这项精心设计的研究仅是花了较长的时间就获得丰硕的成果。”

2015年,中国科学家们首次报道将CRISPR在人胚胎中使用(Protein & Cell, doi:10.1007/s13238-015-0153-5)。在那项报道下,人胚胎具有阻止它们自己存活的染色体异常。而在这项新的研究中,受精卵是有活力的,它们唯一的麻烦在于遗传自父本的MYBPC3基因发生仅4个碱基对的小缺失。

11.Science:重大突破!揭示III型CRISPR-Cas系统中的一种环寡腺苷酸信号通路
doi:10.1126/science.aao0100; doi:10.1126/science.aao2210

为了解决这个问题,在一项新的研究中,来自立陶宛维尔纽斯大学的研究人员研究了嗜热链球菌(Sterptococcus thermophilus)III-A型CRISPR-Cas系统中的Cas10(以下称StCas10)是否具有ATP依赖的催化活性。他们通过生化反应实验证实在嗜热链球菌Csm(以下称StCsm)复合物中,Cas10亚基的GGDD基序负责将ATP转化为一种未知的反应产物X,而且这种反应依赖于Mn2+, Co2+或Zn2+,此外也较低程度地依赖于Mg2+或Fe2+。当然最为关键的是,这种反应特别依赖于靶RNA识别和crRNA 5’-柄与靶RNA的3’端侧边序列之间的非互补性。

为了确定反应产物X的身份,这些研究人员利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC和质谱技术证实反应产物X是一种环寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate, cOA)混合物,其中环三腺苷酸(cA3)是主要的产物。这就表明作为对病毒核酸入侵作出的反应,在StCsm复合物中,Cas10亚基的GGDD活性位点催化cOA合成。鉴于基于核苷酸的小分子化合物,如cAMP、cGAMP、p2Gpp、p3Gpp和NAADP,在多种有机体中作为信号分子发挥作用,他们猜测这些cOA也可能是原核生物的抗病毒防御通路中的信号分子。考虑到这些基于核苷酸的信号分子通常结合到传感蛋白(sensory protein)上,他们也想要鉴定出cOA的传感蛋白。

为了理解Csm6蛋白在嗜热链球菌CRISPR-Cas免疫系统中的作用,这些研究人员发现StCsm6和StCsm6’表现出不依赖于金属离子的单链RNA(ssRNA)降解活性,而且这种降解活性依赖于保守的HEPN活性位点上的氨基酸残基:RXXXXH。显著的是,它们的ssRNA降解活性是较弱的,仅在较高的蛋白浓度(微摩尔范围)下才是明显的。他们猜测StCsm复合物产生的cOA可能作为StCsm6和/或StCsm6’的CART结构域的配体发挥作用。他们首先证实cOA混合物显著地增加StCsm6和StCsm6’的单链RNA酶活性,降低所需的蛋白浓度大约1000倍,而且它们不能够降解双链RNA(dsRNA)和单链DNA(ssDNA),这意味着它们是ssRNA特异性的核酸酶。此外,通过开展一系列实验,他们证实StCsm6和StCsm6’的CARF结构域作为StCsm复合物产生的cOA配体的传感蛋白发挥作用。

为了确定哪种cOA是StCsm6和StCsm6’的激活物,这些研究人员开展核酸酶测试,结果揭示出在所有测试过的cOA中,仅cA6(环六腺苷酸)激活StCsm6和StCsm6’的RNA酶活性。有趣的是,是cA4(环四腺苷酸)而不是cA6激活TtCsm6的RNA酶活性。在相同的反应条件下,线性的寡腺苷酸并不激活StCsm6或TtCsm6。这似乎表明cOA是多种III型CRISPR-Cas系统中通用的信号分子。这一发现提示着Csm6/Csx1和与Csm/Cmr复合物结合的其他CARF家族蛋白可能是由cOA调节的。

我们的DNA上的自然差异可能通过抑制Cas9切割合适的基因靶标或者任何一种靶标的能力,降低CRISPR对人类基因组进行精准编辑的能力。详细地分析这个问题的严重程度,可能对基因组编辑技术如何在临床试验中进行测试和它们是否能够被广泛地使用产生影响。这种分析的结果于2017年7月31日在线发表在Nature Medicine期刊上,论文标题为“Implications of human genetic variation in CRISPR-based therapeutic genome editing”。

在这项新的研究中,布罗德研究所的David Scott和Feng Zhang分析了来自外显子组集合联合(Exome Aggregation Consortium, ExAC)和千人基因组(1,000 Genomes, 1000GP)数据库的数据,结果发现DNA差异显著地影响Cas9等RNA引导的核酸内切酶的作用效果。ExAC和1000GP数据库收录了人类基因变异方面的数据。

作为这项研究的一部分,Scott和Zhang研究了针对与影响大脑、肾脏、胆固醇和血管生长等的疾病相关联的12个基因设计的单个向导RNA(gRNA)。依赖于基因上存在的人基因组特征,这些gRNA的脱靶位点数量位于0到10000多个之间。

Zhang和Scot说,GUIDE-seq和CIRCLE-seq等筛选策略能够在全基因组范围内揭示RNA引导的核酸酶的脱靶切割活性,应当被用来准确地找到针对特定疾病的最佳的gRNA-核酸酶组合。

12.PNAS:首次利用CRISPR-Cas9对古生菌进行基因组编辑
doi:10.1073/pnas.1618596114

在一项新的研究中,来自美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的微生物学教授Bill Metcalf和博士后研究员Dipti Nayak首次记录了在古生菌(Archaea,也译作古细菌,或古菌)中使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。他们的突破性工作有潜力在未来极大地加快研究这类有机体,包括对全球气候变化的影响。相关研究结果于2017年3月1日在线发表在PNAS期刊上,论文标题为“Cas9-mediated genome editing in the methanogenic archaeon Methanosarcina acetivorans”。

Nayak解释道,“在大多数情形下,作为我们的模式古生菌,乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)的倍增时间是8到10小时,而大肠杆菌能够在大约30分钟内增殖一倍。这意味着进行遗传学研究和获得突变体能够需要数月时间,而同样的事情在大肠杆菌中开展仅需三天。在通常情况下,CRISPR-Cas9能够让我们做的事情就是加快这整个过程。它解决了一个重大的瓶颈:在这种古生菌中开展遗传学研究。再者,利用我们之前的技术,必须一步一步地引入突变。利用这种新的技术,我们能够同时引入多种突变。我们能够利用CRISPR指数级地扩大这个突变体产生过程。”

为了在细胞中使用CRISPR系统,研究人员必须开发出一种将细胞偏好的DNA修复系统考虑在内的操作方法:在CRISPR“分子剪刀”切割染色体后,细胞的修复系统介入进来,通过一种能够被用来移除或添加附加的遗传物质的机制修复这种DNA损伤。在真核细胞中,这种修复机制为非同源末端连接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)。尽管这种机制用于CRISPR介导的基因组编辑中,但是它往往在修复过程中产生遗传错误:作为DNA梯子中的横档,核苷酸经常在切割位点上被加入或移除。

NHEJ机制在包括古生菌在内的原核生物中是非常罕见的;相反,它们的DNA损伤更多的时候是通过一种被称作同源重组修复(homology-directed repair, HDR)的机制加以修复的。通过将DNA损伤与一种DNA模板进行比较,HDR机制获得一种“确定性的模板”,其最终结果能够被提前预测,并且能够按照研究人员的需要加以精确地调整。

Nayak解释道,在很多方面,HDR机制确实适合于基因组编辑:“由于NHEJ的存在,我们想要在真核生物中利用CRISPR-Cas9进行定向编辑。就这点而言,大多数古生菌菌株并没有NHEJ机制倒是个好消息,因此,它们的唯一能够修复DNA的途径就是这种确定性的同源修复机制(即HDR)。”

尽管看起来似乎违反直觉,Nayak和Metcalf的首批CRISPR-Cas9应用之一就是在乙酸甲烷八叠球菌中引入NHEJ机制。Nayak说,尽管通常不大适合用于基因组编辑,但是NHEJ也有优于HDR机制的地方:“如果你仅想要移除一个基因,如果不在乎如何移除...,那么NHEJ机制实际上更加高效。”

Nayak说,通过这种引入的NHEJ修复系统开展基因敲除研究,即单个基因被移除或沉默以便观察会产生什么变化和这个基因可能影响哪些过程,未来的研究将能够组装出乙酸甲烷八叠球菌和其他的古生菌物种的基因图谱。

13.Science:从结构上揭示CRISPR/Cas系统的Cas1-Cas2整合酶发现靶DNA机制
doi:10.1126/science.aao0679
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读
蛋白IHF(蓝色)在CRISPR短回文重复序列的上游产生一种个急转弯,从而允许Cas1-Cas2(绿色和黄色)识别和结合插入位点。图片来自Addison Wright, UC Berkeley。
在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员发现Cas1-Cas2如何找出它们将病毒DNA片段插入到细菌基因组中的这个位点,这样Cas1-Cas2随后就能够识别这种病毒DNA片段和发起攻击。相关研究结果于2017年7月20日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Structures of the CRISPR genome integration complex”。

论文通信作者Jennifer Doudna和她的研究团队利用电子显微技术和X射线晶体分析技术捕获到Cas1-Cas2将病毒DNA片段插入到细菌基因组的CRISPR区域中时的结构图。

这些结构图揭示出第三种蛋白IHF(在Cas1-Cas2整合酶中,Cas1是第一种蛋白,Cas2是第二种蛋白)结合到这个插入位点的附近,让靶DNA弯曲成一种U形结构,从而允许Cas1-Cas2同时结合到靶DNA的两个末端上。

14.Nature:重大突破!发现III型CRISPR-Cas系统新的作用机制
doi:10.1038/nature23467

在一项新的研究中,瑞士苏黎世大学的Martin Jinek领导的一个国际研究团队史无前例地发现细菌保护自己免受侵入性病毒攻击的一种新的防御机制。当遭受入侵时,作为细菌免疫系统的CRISPR-Cas系统产生一种化学信号来激活第二种酶,从而协助降解这些入侵者的遗传物质。这一过程非常类似于人先天性免疫系统的一种抗病毒机制。相关研究结果于2017年7月19日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Type III CRISPR–Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers”。

CRISPR-Cas系统的这种靶向复合物由源自规律间隔性成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的RNA序列(即crRNA)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)组成。crRNA识别入侵性病毒的遗传物质,而Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割它。在CRISPR-Cas系统的一个亚型(被称作III型CRISPR-Cas系统)中,该团队取得一项令人吃惊的发现。当这种靶向复合物识别入侵性病毒时,它合成“第二种信使”:一种小的环状RNA分子,即环寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate)。这种信号分子能够在细菌细胞内扩散,激活另一种被称作Csm6的RNA降解酶,这种RNA降解酶协助破坏这种病毒的RNA。

15.Nature:从结构上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向机制
doi:10.1038/nature22398

在一项新的研究中,来自丹麦哥本哈根大学的研究人员发现了一种新的被称作Cpf1的分子剪刀如何让DNA解链,并对它进行切割。这个CRISPR-Cas家族成员表现出较高的准确性,能够像全球定位系统(GPS)那样发挥作用以便鉴定出基因组中的靶位点。Cpf1的高精准度将会改进这种技术在修复基因损伤、其他医学应用和生物技术应用上的使用。

这些研究人员成功地可视化观察和描述了Cpf1的工作方式。这种蛋白属于Cas家族,能够切割双链DNA,因而允许启动这种基因组修饰过程。相关研究结果发表在2017年6月22日的Nature期刊上,论文标题为“Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage”。论文通信作者为哥本哈根大学研究员Guillermo Montoya和Stefano Stella。

全世界的科学家们正在努力优化这种基因组编辑技术以便让它变得更加精准和更加高效。为了实现这一点,科学家们也关注特异性地切割DNA的其他蛋白,如Cpf1,对这些蛋白进行操纵能够将它们引导到基因组中的特定位点上。Montoya团队利用X射线衍射晶体分析技术成功地解析出控制这种过程的分子机制。

Montoya说,“我们利用X射线照射Cpf1蛋白晶体,能够在原子分辨率上观察到它的结构,从而能够让我们观察它的所有组分。X射线衍射是被用来解析生物分子结构的主要生物物理学技术之一。”

16.Cell:重大突破!首次从结构上揭示CRISPR-Cas3系统作用机制
doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

在一项新的研究中,来自美国哈佛医学院和康奈尔大学的研究人员获得来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的I型CRISPR复合体的近原子分辨率的图片,揭示出它的作用机制的关键步骤。这些发现提供改善CRISPR在生物医学应用时的效率和准确性所需的结构数据。相关研究结果发表在2017年6月29日的Cell期刊上,论文标题为“Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System”。论文通信作者为哈佛医学院细胞生物徐助理教授Maofu Liao和康奈尔大学研究员Ailong Ke。

这些研究人员利用冷冻电子显微镜技术首次描述出当这种CRISPR复合体装载靶DNA并让它做好被Cas3酶切割的准备时准确发生的一系列事件。他们说,这些结构揭示出一种存在多层错误检测的过程,即存在阻止不想要的基因组损伤的分子冗余(molecular redundancy)。

为了更好地理解CRISPR-Cas如何发挥功能,Liao、Ke和他们的团队着重关注细菌中最常见的CRISPR亚型:1型CRISPR,即利用一种被称作CRISPR Cascade的核糖蛋白复合体(riboprotein complex)捕获DNA,并且利用酶Cas3切割外源DNA。

通过联合使用生化技术和冷冻电子显微镜技术,他们复原出在不同的功能状态下的稳定的Cascade,并且进一步获得Cascade在捕获和加工DNA时分辨率低至3.3埃(大约是一个碳原子直径的3倍)的图片。

17.Cell:中科院生物物理所王艳丽/章新政课题组从结构上揭示Cas13a切割RNA机制
doi:10.1016/j.cell.2017.06.050
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读
图片来自Cell期刊。
作为一种VI-A型CRISPR-Cas系统的一种RN引导的RNA核酸酶,Cas13a降解crRNA靶向的入侵性RNA,在RNA技术中具有广泛的潜在应用。 如今,在一项新的研究中,为了理解Cas13a如何被激活和切割靶RNA,中科院生物物理所中国科学院核酸生物学重点实验室创新课题组组长王艳丽(Yanli Wang)课题组和中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室创新课 题组组长章新政(Xinzheng Zhang)课题组解析出来自口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)的Cas13a(以下称LbuCas13a)结合到crRNA和它的靶RNA上时的晶体结构,以及LbuCas13a-crRNA复合物的冷冻电镜结构。他们证实 crRNA-靶RNA双链结合到LbuCas13a中的核酸酶叶(nuclease lobe, NUC)的一种带正电荷的中心通道内,而且一旦结合靶RNA,LbuCas13a和crRNA经历显著的构象变化。这种crRNA-靶RNA双链形成促进LbuCas13a的HEPN1结 构域移向HEPN2结构域,从而激活LbuCas13a的HEPN催化位点,随后LbuCas13a就以一种非特异性的方式切割单链靶RNA和其他的RNA。

这些发现揭示出VI型CRISPR-Cas系统的Cas13a抵抗RNA噬菌体的作用机制,这就为将它作为一种RNA操纵工具加以应用铺平道路,如将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

18.CRISPR专利争夺者再放大招!Nature、Cell两篇文章发现10种用于疾病诊断的CRISPR酶
doi:10.1016/j.molcel.2017.04.008; doi:10.1038/nature19802

最近来自加利福尼亚大学的研究人员通过研究描述了10种新型的CRISPR酶,这些酶一旦被激活其行为就像“吃豆人”一样能够“嚼碎”RNA,因此这些酶类或许能作为诊断传染性病毒的敏感检测器。这种新型的酶类是CRISPR蛋白—Cas13a的突变体,去年9月,来自伯克利的研究人员利用该蛋白实现了对来自病毒RNA的特异性序列进行检测,同时研究者表示,一旦CRISPR—Cas13a同其靶点RNA相结合后,其就会开始切割RNA,从而就能够轻松切掉和受体分子相关的RNA,并且产生荧光帮助研究者进行信号检测。

此前来自博德研究所的两个研究小组相继对CRISPR—Cas13a和RNA进行配对,并将构建好的新系统命名为SHERLOCK系统,该系统能够在极低浓度下对病毒的RNA进行检测,比如对登革热和寨卡病毒的RNA进行检测等。诸如这种系统就能够用来检测任何类型的RNA,包括癌细胞特异性的RNA。

当伯克利和博德研究所的研究人员发现使用的原始的Cas13a酶仅能够在特定核苷酸位点(尿嘧啶)对RNA进行切割时,本文中研究者发现了其中三种新型的Cas13a突变体则能够在腺嘌呤位点切割RNA,这种差异性就能够实现同时检测两种不同的RNA分子,比如来自两种不同病毒的RNA。研究者Alexandra East-Seletsky表示,我们通过深入研究发现了具有不同核苷酸的Cas13a家族的其它同系物,这就能够对携带红色和绿色荧光信号的不同受体分子进行同时检测,从而帮助研究者开发多通道的酶类检测系统。

研究者East-Seletsky表示,把Cas13a与RNA靶点结合看作一种开关,靶向作用该开关就能够开启酶类的表达使其成为细胞中的“吃豆人”来切割附近的RNA分子。发表在Nature杂志上的研究报告中,伯克利的研究人员讨论了CRISPR—Cas13a所具有的活性是否能在细菌中扮演关键角色,从而帮助细菌杀灭感染性的病毒或噬菌体,作为一些细菌的部分免疫系统组分,CRISPR—Cas13a能够促进感染的细胞自杀从而帮助抵御其它细菌细胞免于被感染,类似的非CRISPR自杀细菌在其它其中中也存在。

随后研究人员对细菌基因组数据库进行搜寻,发现了10个其它的Cas13a样蛋白,随后研究者对这些蛋白进行了合成,并且评估其切割RNA的能力,其中有7个蛋白类似原始的Cas13a,另外3个则能够对RNA进行切割。基于前期的研究结果,研究人员表示,他们或许能够多元化地使用这些酶类,并且扩展该技术的使用范围,CRISPR-Cas13a家族或许还有其它多种用途,比如进行RNA检测等。最后研究者Doudna说道,我们未来的研究目的就是开发用于多个医疗点诊断的强大Cas13a酶类家族。

19.Nat Biotechnol:利用CRISPR表观基因组编辑鉴定人基因组中的功能性调节元件
doi:10.1038/nbt.3853

大多数DNA并不编码蛋白。了解这种基因组“暗物质”如何和何时在基因调节的何处发挥作用是一个巨大的任务。如今,科学家们开发出的一种工具可能提供帮助。在一篇于2017年4月3日在线发表在Nature Biotechnology期刊上的论文中,来自美国杜克大学的研究人员描述了一种高通量筛选技术:利用CRISPR-Cas9表观基因组编辑鉴定人细胞基因组中的调节元件。这篇论文的标题为“CRISPR–Cas9 epigenome editing enables high-throughput screening for functional regulatory elements in the human genome”。论文通信作者为来自杜克大学的Gregory E Crawford、Timothy E Reddy和Charles A Gersbach。

研究结果证实导致更常见的复杂疾病(如心血管疾病、糖尿病和神经系统疾病)的大多数基因变异实际上发生于基因之间的调节区域。令人兴奋的事情是有方法对非编码基因组的功能进行标注。

Gersbach和同事们构建出靶向两个感兴趣的基因位点β-globin和HER2周围的几百万个碱基中的潜在调节元件的向导RNA(gRNA)文库。他们随后产生整合着荧光蛋白的细胞系,其中这种荧光蛋白指示靶基因激活。

这些研究人员将核酸酶活性已被灭活的两种Cas9蛋白版本(被称作dCas9)--- dCas9抑制版本(dCas9KRAB)和dCas9激活版本(dCas9p300)---中的一种导入到他们产生的细胞系中。dCas9KRAB招募让组蛋白H3K9发生甲基化的蛋白,从而导致异染色质形成和靶序列上的基因抑制。dCas9p300结合到靶DNA增强子或启动子上,促进组蛋白H3K27发生乙酰化,从而导致基因激活。

接下来,这些研究人员将较低水平的gRNA文库导入到他们产生的细胞系中以便确保单个gRNA存在于每个细胞中。他们随后基于荧光分选这些细胞,并且对存在于发生特别高水平和低水平靶基因表达的细胞中的gRNA进行测序。

序列鉴定印证了已知的调节元件,并且揭示出其他的DNA序列的新作用。很多这些序列(尽管不是所有序列)出现在dCas9KRAB筛选和dCas9p300筛选中。一些序列似乎对一种细胞类型中的基因发挥着调节作用,但是对另一种细胞类型中的相同基因并不会起着调节作用。尽管这些观察到的基因表达变化是微妙的,但是这些研究人员证实了单个DNA序列的调节作用。

20.Nature:“武林高手”细菌CRISPR系统VS病毒,以快为尊
doi:10.1038/nature21719
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读
CRISPR与DNA片段,大肠杆菌。图片来自Mulepati, S., Bailey, S.; Astrojan/Wikipedia/CC BY 3.0。
CRISPR是一种细菌免疫系统。它也是一种强大的基因组编辑工具。在与病毒的斗争当中,打响的第一枪通常是注射。想要感染细菌的病毒刺入细菌细胞的保护性细胞壁,注入它自己的遗传密码。如今,来自美国洛克菲勒大学的一项新的研究揭示出细菌如何利用CRISPR快速地抵抗这种到来的威胁。这一发现解答了一个由来已久的CRISPR如何发挥作用的难题。相关研究结果于2017年3月29日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“CRISPR–Cas systems exploit viral DNA injection to establish and maintain adaptive immunity”。

科学家们已经了解的基础事实是:当细菌细胞被病毒DNA入侵时,它的CRISPR系统捕获病毒的DNA片段(即间隔序列),并对这些DNA片段进行登记。一旦相同的病毒再次入侵,这种CRISPR系统就快速地识别它。

论文通信作者、洛克菲勒大学细菌学实验室主任Luciano A. Marraffini说,“大约10年来,我们已知道CRISPR系统通过获取病毒DNA片段发挥作用,但是在CRISPR免疫系统中这种关键的步骤在感染期间何时发生仍然是个谜。”他研究当地细菌中的CRISPR系统。

为了阐明这种时间安排,Marraffini和他的团队设计实验:在不同的时间点上阻止病毒生命周期。博士后研究员Joshua W. Modell和研究生Wenyan Jiang随后研究了CRISPR系统以便观察它何时和如何获得来自病毒的间隔序列(spacer)。

并不是任何病毒DNA都对CRISPR有用。之前的研究已证实,它偏好来自DNA松散末端的间隔序列。这种偏好缩小了它的选择,这是因为病毒DNA仅在感染的某些时间点采取线性形式,而在它的感染的剩余时间,它的DNA两个末端连接在一起,形成一种环形结构。

Marraffini团队在三个时间点上阻止这种病毒感染。但是不论他们在何时阻断这种感染,CRISPR持续地获得间隔序列,这表明它从一开始,也就是在病毒注射它的基因组到细菌细胞中的时候,就获得它们。

这种时间安排比较重要。通过从病毒首先注入细菌细胞中的DNA末端获得间隔序列,CRISPR确保一旦这种感染下次再次出现,它就攻击这种病毒。当Marraffini团队改变CRISPR系统使得它含有与病毒最后注入细菌细胞中的DNA末端相匹配的间隔序列时,病毒仍然能够增殖。

21.Cell:重磅!揭示抗CRISPR蛋白阻断CRISPR系统机制
doi:10.1016/j.cell.2017.03.012

想象一下细菌和病毒一直处于军备竞赛之中。对很多细菌而言,一种抵抗病毒感染的防御线是一种复杂的RNA引导的“免疫系统”,即CRISPR-Cas。这个免疫系统的核心是一种识别病毒DNA和触发它破坏的监视复合物。然而,病毒能够反击,利用抗CRISPR蛋白让这种监视复合物不能够发挥功能。但是,在此之前,没有人准确地知道这些抗CRISPR蛋白如何发挥作用。

如今,来自美国国家过敏症与传染病研究所、斯克里普斯研究所、蒙大拿州立大学、加州大学旧金山分校和加拿大多伦多大学的研究人员首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附着到一种细菌CRISPR监视复合物上时的结构。他们发现抗CRISPR蛋白的作用机制是封锁CRISPR识别和攻击病毒基因组的能力。一种抗CRISPR蛋白甚至“模拟”DNA,让这种crRNA(CRISPR经转录产生的RNA)引导的检测机器脱轨。相关研究结果发表在2017年3月23日的Cell期刊上,论文标题为“Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex”。论文通信作者为来自斯克里普斯研究所的Gabriel C. Lander和来自蒙大拿州立大学的Blake Wiedenheft。

利用一种被称作冷冻电镜的高分辨率成像技术,这些研究人员发现了CRISPR系统和抗CRISPR蛋白的三个重要的方面。

首先,他们准确地观察这种CRISPR监视复合物如何识别病毒遗传物质以便发现它应当在何处发起攻击。这种监视复合物中的蛋白像握手那样缠绕在细菌crRNA的周围,让这种crRNA的特定片段暴露出来。这种特定片段扫描病毒DNA,寻找它们能够识别的基因序列。再者,这些研究人员分析了病毒抗CRISPR蛋白如何瘫痪这种监视复合物。他们发现一种抗CRISPR蛋白覆盖住crRNA的这个暴露片段,从而阻止这种CRISPR系统扫描病毒DNA。

另一种抗CRISPR蛋白采用一种不同的策略。基于这种抗CRISPR蛋白的结合位置和负电荷,这些研究人员认为它起着模拟DNA的作用,诱导CRISPR结合这种抗CRISPR蛋白,而不是入侵的病毒DNA。

这些研究人员认为这种对抗CRISPR蛋白的新认识可能最终导致人们开发出更加复杂的和更加高效的基因编辑工具。抗CRISPR蛋白可能能够被用于CRISPR系统之中来迅速阻断基因编辑,或者科学家们可能能够降解抗CRISPR蛋白来触发基因编辑。

22.Science:基于CRISPR/Cas13a的诊断平台可检测任何RNA分子,灵敏度增加一百万倍
doi:10.1126/science.aam9321

在一项新的研究中,来自美国哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所(以下简称布罗德研究所)、麻省理工学院麦戈文脑研究所、麻省理工学院医学工程与科学研究所、哈佛大学怀斯生物启发工程研究所(Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering)的研究人员将一种靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相关酶(即Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具,从而有潜力引发研究和全球公共卫生变革。相关研究结果于2017年4月13日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在这项研究中,布罗德研究所成员Feng Zhang、Jim Collins、Deb Hung、Aviv Regev和Pardis Sabeti描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶如何被用作一种高度灵敏的检测器---能够指示最少至一个靶RNA或DNA分子的存在。论文第一作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg将这种新的工具称为“SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)”;这种技术可能有朝一日被用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症。

在2016年6月,Zhang和他的同事们首次描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶(之前被称作C2c2,如今被称作Cas13a),而且能够经编程后切割细菌细胞中的特定RNA序列(Science, Published online:02 Jun 2016, doi:10.1126/science.aaf5573)。不同于靶向DNA的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a能够在切割它的靶RNA之后保持活性,而且可能表现出不加区别的切割活性,而且在一系列被称作“附带切割(collateral cleavage)”的作用当中,继续切割其他的非靶RNA。在其发表的论文和申请的专利中,该团队描述了这个CRISPR系统的广泛生物技术应用,包括将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

在这项新的研究中,这种SHERLOCK方法的灵敏度增加了一百万倍。这种增加是由于Zhang团队和布罗德研究所成员Jim Collins合作开展研究取得的结果。Collins之前一直在研究寨卡病毒的诊断方法(Cell, 19 May 2016, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059)。在2014年,Collins和他在怀斯生物启发工程研究所的团队开发出一种快速的基于合成纸的埃博拉病毒测试方法,该方法所使用的试剂能够在室温下运输和储存。他们随后对这种测试系统进行修改来检测寨卡病毒,并且证实他们能够通过加入低水平热量来提高RNA在样品中的浓度来提高这种系统的检测灵敏度。 通过一起合作,Zhang团队和Collins团队能够采用一种不同的依赖体温的扩增过程来提高他们的测试样品中的DNA或RNA水平。一旦这种水平增加,他们利用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA,从而使得他们将这种靶向RNA 的CRISPR工具的灵敏度增加了一百万倍,而且这种工具能够在几乎任何环境下使用。

另外,这种CRISPR工具还包括一种RNA报告分子。当该报告分子被切割时,它会发出荧光。当Cas13a检测到靶RNA序列时,它的无区分的RNA酶活性(即附带切割活性)也会切割这种RNA报告分子,从而释放可检测到的荧光信号。

23.Nat Biotechnol:首次利用CRISPR培育出单核苷酸编辑转基因小鼠
doi:10.1038/nbt.3816

人类DNA由大约30亿个核苷酸组成。在某些情形下,仅一个核苷酸发生变化就能够导致严重的疾病。科学家们希望利用一个正确的核苷酸替换这个不正确的核苷酸,从而治愈这些疾病。然而,利用当前的基因编辑工具CRISPR-Cas9替换单个核苷酸存在技术上的挑战。如今,在一项新的研究中,来自韩国基础科学研究所(Institute for Basic Science, IBS)基因组工程中心的研究人员利用这种流行的基因编辑技术CRISPR-Cas9的一种变体版本培育出单核苷酸编辑小鼠。相关研究结果于2017年2月27日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos”。

作为近年来出现的一种卓有成效的基因编辑技术,CRISPR-Cas9的作用机制是在DNA双链中的一个发生突变的核苷酸附近进行切割,切除一小段DNA序列。相反,IBS研究人员采用Cas9蛋白的一种变体:切口酶Cas9(nickase Cas9, nCas9),同时让Cas9与一种被称作胞苷脱氨酶(cytidine deaminase, CD)的蛋白融合在一起。CRISPR-nCas9-CD能够将一种核苷酸替换另一种核苷酸,因而也被称作碱基编辑器(Base Editor)。2016年,美国哈佛大学的David Liu团队和日本神户大学的Keiji Nishda团队已开发出这种类型的脱氨酶,并且在体外培养的细胞系中进行过测试。IBS研究人员通过将这种技术用于小鼠胚胎中,进一步推动它的发展。

IBS研究人员在小鼠体内测试了CRISPR-nCas9-CD是否能够校正Dmd基因(编码抗肌萎缩蛋白)或Tyr基因(编码酪氨酸酶)中的单个核苷酸。他们在这两种基因中都取得成功:由Dmd基因发生单核苷酸突变的胚胎发育而成的小鼠在它们的肌肉中不产生抗肌萎缩蛋白(dystrophin),而Tyr基因发生单核苷酸突变的小鼠表现出白化性状。抗肌萎缩蛋白确实与肌肉肌营养不良疾病相关联,而酪氨酸酶控制黑色素产生。

再者,这两种单核苷酸替换仅出现靶位点上。这是比较重要的,这是因为它表明仅靶位点上的突变核苷酸遭受替换。论文通信作者、IBS基因组工程中心主任KIM Jin-Soo陈述道,“我们首次证实可编程的脱氨酶在小鼠胚胎中高效地诱导核苷酸替换,从而培育出具有疾病表型的突变小鼠。这是一项概念验证实验。下一个目标是在动物中校正基因缺陷。最终,这种技术可能允许在人类胚胎中进行基因校正。”

24.Nature:利用CRISPR/Cas9构建出更加强效的CAR-T细胞
doi:10.1038/nature21405
2017年度巨献:CRISPR/Cas重磅级研究TOP25解读

在一项新的研究中,来自美国斯隆凯特林癌症纪念中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的研究人员利用CRISPR/Cas9的力量构建出更加强效的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor CAR)T细胞(CAR-T细胞),从而增强小鼠体内的肿瘤免疫排斥。这一出于意料的发现揭示出CAR免疫疗法的一些细节,并且突出展现了利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术推动癌症免疫疗法的潜力。

CRISPR/Cas9是一种基因组编辑工具,能够让科学家们精确地切割和操纵细胞中的DNA。在这项新的研究中,这些研究人员证实CRISPR/Cas9技术能够运送CAR基因到T细胞基因组中的特定位点上。这种精准的方法能够更强健地构建出CAR-T细胞---它们能够持续更长的时间地杀死肿瘤细胞,这是因为它们更不容易耗竭。这可能潜在地导致在病人体内更加安全地和更加高效地使用这种强大的免疫疗法。

论文通信作者、斯隆凯特林癌症纪念中心基因转移与基因表达实验室科学家Michel Sadelain博士说,“癌细胞总是无休止地试图躲避治疗,因此我们需要能够制造出与它们相匹配的并且比它们活得更长的CAR-T细胞。这一新的发现证实我们可能能够利用基因组编辑的力量内在地改进这些‘活细胞疗法’。我们迫切地持续探究基因组编辑技术如何可能给我们提供下一代CAR-T细胞疗法。”

25.Cell:中科院解析VI型CRISPR-Cas系统C2c2-RNA复合物结构
doi:10.1016/j.cell.2016.12.031

1月12日,Cell 杂志发表了中科院生物物理研究所王艳丽课题组关于Ⅵ型CRISPR-Cas系统的效应蛋白C2c2的结构研究。标题为“Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities”。该研究解析了Leptotrichia shahii(Lsh)细菌中C2c2与crRNA (CRISPR-RNA) 的二元复合物以及C2c2在自由状态下的晶体结构,揭示了LshC2c2通过两个独立的活性结构域来发挥其两种不同的RNA酶切活性,这为研究C2c2发挥RNA酶活性的分子机制提供了重要的结构生物学基础。

2015年,一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-Ⅵ型系统被发现,该系统中的效应蛋白被命名为C2c2。而后的研究进一步发现,Ⅵ型CRISPR-Cas系统是一种新型靶向RNA的CRISPR系统,而C2c2是一种以RNA为导向靶向和降解RNA的核酸内切酶,有望被开发作为RNA研究的工具,扩展CRISPR系统在基因编辑方面的运用。

王艳丽课题组通过深入的研究,解析了C2c2与crRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构,揭示了C2c2包含一个crRNA识别的叶片即REC叶片,和一个核酸酶叶片即NUC叶片。REC叶片包含NTD结构域(N-terminal domain)和Helical-1结构域,NUC叶片包含了两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域。负责切割前体crRNA和靶标 RNA的活性口袋分别位于Helical-1和HEPN结构域上。crRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化,这种变化很可能会稳定crRNA的结合,进而对识别靶标RNA起着重要作用。该研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶标 RNA的分子机制,对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统,为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础,有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。(生物谷 Bioon.com)

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