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应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

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摘要:亮点免疫组化等传统组织蛋白原位检测方法不适用于长链非编码的可视化但原位杂交技术可以在完整的形态背景下检测单细胞水平表达下述研究利用技术检测了肿瘤组织中几个并分析了该其与基质细胞的关系这项研究表明检测技术可原位检测肺癌样本中的生物

亮点

免疫组化(IHC)等传统组织蛋白原位检测方法不适用于长链非编码RNAs(lncRNA)的可视化,但RNAscope® RNA原位杂交技术可以在完整的形态背景下检测单细胞水平lncRNA表达。下述研究利用RNAscope®技术检测了肿瘤组织中几个lncRNAs并分析了该其与基质细胞的关系。这项研究表明,RNAscope®检测技术可:
· 原位检测肺癌样本中的lncRNA生物标志物;
· 精准识别lncRNAs的空间表达模式,包括肿瘤内异质性表达和肿瘤vs.间质表达;
· 鉴定lncRNAs特异性细胞类型及其亚细胞定位。

引言——lncRNAs & RNAscope

长链非编码RNAs(lncRNAs)参与许多生物学过程,包括表观遗传修饰、细胞分化和凋亡。近期研究表明,lncRNAs是一种独特的生物标志物,可能与生理或疾病状态有关,已有几种lncRNAs被认定为多种人类癌症的生物标志物1。因为其不能翻译成蛋白质,lncRNAs的发现完全依赖于RNA检测。大多数lncRNAs表达水平偏低,且与mRNA相比,表达异质性较强。因此,肿瘤组织中的lncRNAs检测要求使用高灵敏度和高特异性的方法,可以识别lncRNA在单细胞水平的其亚细胞定位。

单分子RNA原位杂交(ISH)可以在完整的形态学背景下检测到单个RNA分子,非常适用于检测肿瘤组织中lncRNAs。

为探索lncRNAs在肿瘤组织的表达模式及其所处的微环境,我们使用RNAscope®检测技术进行RNA原位杂交。该方法是一种独特的RNA原位杂交技术,可在完整的空间与形态背景下,表征单细胞水平的基因表达。RNAscope®检测技术采用了独特的双Z探针设计及信号放大策略,同时抑制了背景,检测新鲜冷冻、固定冷冻和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的细胞和组织中的mRNA与lncRNA,可以将目标RNA可视化为单一的信号点,一个信号点对应一个RNA分子2。RNAscope®技术的关键优势在于基于放大策略的高灵敏度以及基于双Z探针设计的高特异性,使其在大多数组织中有很高的信噪比。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

「优势看得见」用RNAscope® 2.5HD检测试剂盒(红色)可视化人非小细胞肺癌福尔马林固定石蜡包埋组织中的lncRNAs表达。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

相逢欲话

应用RNAscope® 2.5HD检测试剂盒(红色),在56例原发性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织和4例癌旁肺组织的石蜡包埋组织芯片中,检测了4种肺癌预后标志物lncRNAs(AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1)的表达3-6,以及前列腺癌特异性标志物lncRNA PCA3的表达。

情理之中

这4种肺癌预后标志物lncRNAs在各组织样本中的表达水平存在差异,在56例NSCLC肿瘤组织中,近一半的样本组织中可以检测到上述4种lncRNAs表达,而在4例癌旁组织中并未检测到相关表达(图1;表1)。

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图1.一系列 lncRNAs在NSCLC肿瘤组织中的表达水平。应用RNAscope® 2.5HD检测试剂盒(红色),在60例NSCLC样本中检测5种lncRNAs(AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR、UCA1和PCA3)的表达。观察每种lncRNA的(高、中、低、无)表达水平。在本项研究中,癌旁正常组织中没有检测到任何lncRNAs表达信号。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

    
表 1. RNAscope®染色评分汇总。NSCLC肿瘤组织中特定RNAscope®染色评分的分布。根据明视野显微镜下染色信号点的数目对染色结果进行评分:0,无染色或每10个细胞<1个染色信号点;1+,每个细胞存在1-3个信号点;2+,每个细胞存在4-10个信号点且不存在或仅存在极少的信号点聚集;3+,每个细胞存在10-15个信号点且<10%信号点聚集;4+,每个细胞存在>15个信号点且>10%信号点聚集。*阳性表达率根据在除癌旁正常组织外的所有NSCLC肿瘤组织内的RNAscope?染色评分≥1的染色信号点计算。

有趣的是,我们还观察到,PCA3在16例癌组织中呈现较低表达,而在癌旁组织中却未检测到相关表达(图1)。仅有部分研究表明肺癌组织中存在PCA3表达。RNAscope®技术灵敏度高,即使RNA生物标志物的表达水平较低,也可以被检测出来,使研究人员可以在多种组织中检测lncRNAs的表达。此外,尽管有3种肺癌预后标志物lncRNA在68%的NSCLC肿瘤组织中可以检测到表达,这也并不表示在同一肿瘤组织内同时存在这些lncRNAs表达(图2)。

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图2. 不同种lncRNA在同一NSCLC肿瘤组织中的表达差异。尽管有3种lncRNAs检测到在68%的NSCLC肿瘤组织中表达,但并非每个肿瘤组织都存在相同的lncRNA表达谱。(A)在组织1E5中,HOTAIR的表达水平高于AFAP1-AS1、ANRIL或UCA1。(B)在组织1F3中,AFAP1-AS1的表达水平明显高于ANRIL、HOTAIR或UCA1。(C)有部分组织也检测到这4种肺癌预后生物标记物lncRNA表达。右图为左图红色框放大内容,显示的是在同一染色区域内,连续切片在组织1D5中AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1的染色情况。

在56例NSCLC肿瘤组织中还观察到一些有趣的lncRNA表达模式。首先,这4种肺癌lncRNA生物标志物主要表达在肿瘤细胞中,而很少甚至不在基质细胞中表达(图3)。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

  
图3. 肿瘤和基质质中的lncRNA表达评估。lncRNA主要表达于肿瘤细胞,很少甚至不在基质中表达。为了证实这一点,我们使用HALO数字成像分析软件,对lncRNA在肿瘤中(黄色框)、基质质(绿色框)以及整个肿瘤核心区域(红色框)中的表达水平进行了量化分析。每个细胞的平均信号点代表每个区域的数量。

第二,AFAP1-AS1在多个肿瘤组织内呈现出异质性表达,包括相邻肿瘤灶存在表达或无表达,以及在肿瘤细胞之间存在表达差异(图4)。

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图4. AFAP1-AS1在多种NSCLC肿瘤中的瘤内异质性表达。在本研究中,并非所有的肿瘤细胞均存在检测的这几种lncRNAs表达。(A)同一个NSCLC组织的邻近病灶存在不同的AFAP1-AS1表达模式。一个病灶中检测出AFAP1-AS1阳性肿瘤细胞(箭头),而另一个临近病灶却检测出AFAP1-AS1阴性肿瘤细胞(星号)。为了确保阴性病灶中RNA质量符合研究标准,我们对管家基因PPIB进行了研究,发现PPIB在两个病灶中表达一致。(B)在同一肿瘤区域内的两个NSCLC肿瘤核心区域,同时检测出AFAP1-AS1阳性肿瘤细胞(箭头)和阴性肿瘤细胞(星号)。

第三,在一些NSCLC肿瘤组织中,高表达的UCA1几乎主要位于与肿瘤相关的基质细胞中(图5)。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

图5. 多种NSCLC肿瘤中UCA1在肿瘤相关基质细胞中的表达。在一些NSCLC肿瘤组织中检测UCA1表达,检测结果发现仅在肿瘤相关基质细胞的细胞亚群中存在lncRNA高表达。

最后,由于ANRIL和HOTAIR均通过表观遗传机制调节基因表达,我们采用RNAscope®2.5 HD双通道试剂盒检测这两个lncRNAs与染色质重组因子EZH2 mRNA的共表达。在一些NSCLC肿瘤组织中,我们观察到ANRIL或HOTAIR与EZH2的共表达情况主要存在于肿瘤细胞中(图6)。

应用RNAscope®原位杂交技术分析肺癌中lncRNAs的细胞和亚细胞定位

图6. lncRNA与染色质重组因子EZH2在多种NSCLC肿瘤中的共表达。用RNAscope® 2.5 HD多通道检测试剂盒检测发现ANRIL(A)或HOTAIR(B)lncRNA(红)与EZH2 mRNA (绿)主要共表达于肿瘤细胞。

意料之外

此项研究中,应用RNAscope®原位杂交技术,在60例NSCLC福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的肿瘤微环境中,评估几种肺癌预后生物标志物lncRNAs的表达谱。检测结果表明,该检测技术能够原位检测肺癌样本中潜在的生物标志物lncRNA,而且具有较高的灵敏度和特异性,可以有效识别组织环境中的lncRNA表达异质性和确定肿瘤组织中的lncRNA表达模式。鉴定细胞类型特异性和lncRNA表达的亚细胞定位有助于理解lncRNA在癌症和其他疾病中的特定生物学作用。

     
更多信息请访问
www.acdbio.com/lncRNA

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Reference:
1.Schmitt AM and Chang HY. Long noncoding RNAs in cancer pathways. Cancer Cell. 2017; 29: 452-463.
2.Wang F, et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 2012;14(1):22-9.
3.Deng J, et al. The up-regulation of long non-coding RNA AFAP1-AS1 is associated with the poor prognosis of NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 2015; 75:8-11.
4.Lin L, et al. Increased expression of the long non-coding RNA ANRIL promotes lung cancer cell metastasis and correlates with poor prognosis. Diagn Pathol. 2015; 10: 14.
5.Liu XH, et al. The long non-coding RNA HOTAiR indicates a poor prognosis and promotes metastasis in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2013; 13: 464.
6.Wang HM, et al. Upregulated IncRNA-UCA1 contributes to progression of lung cancer and is closely related to clinical diagnosis as a predictive biomarker in plasma. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(7): 11824-30.

「RNAscope技术」微课堂

RNAscope技术是由美国Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研发的RNA原位杂交产品,在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比,RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术,其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端,配以自身级联放大检测原理,可以高效敏感地检测到目标RNA。该技术优势如下:
1.应用广泛;
2.高特异性;
3.极高灵敏度,单分子可视化和单细胞定量;
4.兼容降解的RNA样本;
5.无需RNase-free操作和环境要求,一天完成实验;
6.检测结果稳定一致性,兼容高通量自动化平台;
7.多通道多靶点同时检测。

(生物谷 bioon.com)

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