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激肽释放酶相关肽酶7损失加剧阿尔茨海默病模型小鼠淀粉样病变

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摘要:稿件来自摘要淀粉样蛋白沉积即老年斑是阿尔茨海默病患者病理特征之一此外虽然星形胶质细胞确切的病理作用尚不明确但是已经发现阿尔茨海默病患者头脑中的胶质细胞活化本文中我们确定激肽释放酶相关肽酶为星形胶质细胞源性降解酶信使核糖核酸的表达在阿尔茨海默病患者的脑中显着下降消融加剧了阿
激肽释放酶相关肽酶7损失加剧阿尔茨海默病模型小鼠淀粉样病变
(稿件来自EMBO Molecular Medicine)
摘 要
淀粉样蛋白‐β(Aβ)沉积(即老年斑)是阿尔茨海默病(AD)患者病理特征之一。此外,虽然星形胶质细胞确切的病理作用尚不明确,但是已经发现阿尔茨海默病患者头脑中的胶质细胞活化。本文中,我们确定激肽释放酶相关肽酶7(KLK7)为星形胶质细胞源性Aβ降解酶。?KLK7信使核糖核酸的表达在阿尔茨海默病患者的脑中显着下降。Klk7?消融加剧了阿尔茨海默病模型小鼠的硫磺素S-阳性Aβ病理。Klk7的表达通过主要星形胶质细胞中的Aβ疗法得以上调,这意味着Klk7通过Aβ诱发反应进行自我平衡调节。最后,我们发现食品和药物管理局批准抗痴呆药物美金刚胺能够提高Klk7表达和Aβ降解活性,尤其是星形胶质细胞的降解活性。这些数据显示KLK7是通过阿尔茨海默病发病机理中涉及的星形胶质细胞退化并清除沉积Aβ种类的重要酶素。
引 言
阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆类型。基因和生化证据显示,淀粉样蛋白‐β(Aβ)沉积是阿尔茨海默病发病机理的重要过程(Holtzman等人,2011年)。淀粉样前蛋白(app)发生蛋白水解作用后产生Aβ。有些基因突变与家族阿尔茨海默病增加或产生/累积Aβ相关。与此相反,报告称零星阿尔茨海默病患者清除率降低,而大脑Aβ产生率上升(Mawuenyega?等人,2010年)。因此,了解反映产生、清除并累积Aβ速率平衡的大脑“Aβ经济”分子机制(Karran等人,2011年)对阿尔茨海默病的有效疗法开发非常关键。但是,病理生理学Aβ清除/降解途径在大脑中的整体框架尚不明确(Saido和 Leissring,2012年)。迄今为止,有些酶素,包括脑啡肽酶(膜金属内肽酶)和胰岛素降解酶已经确定为Aβ降解酶(Nalivaeva 等人,2014年)。其中,小鼠体内的脑啡肽酶和胰岛素降解酶清除显示可溶大脑Aβ水平大约提高双倍,即使对活有机体内部Aβ沉积的影响仍然充满争议((Iwata等人,2000年和2001年;Farris等人,2003年;Leissring等人,2003年)。重要的是,在治疗环境中,剩余神经元可能并非阿尔茨海默病治疗过程中清除Aβ沉积的适当靶点。因此,我们侧重星形胶质细胞,星形胶质细胞在大脑生理和病理功能中发挥着重要的作用((De Strooper 和Karran,2016年; Pekny等人,2016年)。星形胶质细胞外表型发生显着变化,但数量并未发生变化,这与阿尔茨海默病的临床病理学相关(Serrano‐Pozo等人,2013年)。
但是,星形胶质细胞调节Aβ清除的明确机制依然尚不明确。
已经确定十五种激肽释放酶相关肽酶7(KLK7)家族蛋白,这些蛋白在复杂的网络中产生级联反应。其中,KLK6(甘油磷酸钙)和KLK8(neuropsin)是中枢神经系统中主要的激肽释放酶相关肽酶蛋白(Sotiropoulou?等人,2009年;Prassas?等人,2015年)。KLK6在几种细胞中的表达广泛,KLK8在神经元中表达。同时,KLK8也在阿尔茨海默病的发病机理中有所表示(Herring等人,2016年)。KLK7最初确定为皮肤中的炎症诱发蛋白酶。但是,阿尔茨海默病患者脑脊液和大脑中的KLK7表达水平下降((Diamandis等人,2004年; Bossers等人,2010年)。此外,报道称KLK7能够打通Aβ小纤维的输水核心结构,从而降低体外的神经中毒性(Shropshire等人,2014年)。在本文中,我们调查了KLK7在大脑Aβ经济中的病理生理学影响并确定KLK7为星形胶质细胞源性Aβ降解酶,星形胶质细胞源性Aβ降解酶能够调节活有机体内部的淀粉样蛋白病理。
结 果
KLK7确定为Aβ降解酶
为确定能够降解分泌Aβ种类的蛋白酶,我们利用了7PA2细胞中的条件培养基作为基质源,因为7PA2细胞分泌有毒人体Aβ低聚体种类(Podlisny等人,1995年)。我们利用若干细胞系的条件培养基并将其与7PA2细胞的条件培养基进行混合。混合物通过含尿素的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶进行分离,含尿素的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶使我们能够区分Aβ免疫印迹不同的C-末端长度(Klafki等人,1996年;Qi‐Takahara等人,2005年)。我们发现星型细胞瘤CCF‐STTG1、神经胶质瘤H4、神经胚细胞瘤SH‐SY5Y和胶质母细胞瘤U87细胞的介质在此条件下表现出强健的Aβ降解活性(图1A和附录图S1A 和B)。此外,CCF‐STTG1细胞的介质也在人神经母细胞瘤BE(2)‐C细胞产生的Aβ上表现出降解活性(附录图S1C)。然后我们利用具有最强活性的CCF‐STTG1细胞进一步表征降解活性。这种活性特别通过二异丙基氟磷酸盐和甲苯磺酰基苯内氨酛基氯甲基酮(图1B和 C)进行抑制,这说明Aβ降解需要分泌的糜蛋白酶类丝氨酸蛋白酶。膦酰二肽、乙二胺四乙酸和GM6001均不会抑制这种活性,这说明这种分解代谢途径并不涉及金属蛋白酶(Fig1B和D)((Iwata等人,2000年;Yin等人,2006年)。但是,已知Aβ降解丝氨酸蛋白酶的抑制剂【如纤维蛋白溶酶的抗纤维蛋白溶酶((Van Nostrand 和Porter,1999年)和酰基肽水解酶乙酰蛋氨酸(Yamin等人,2007年)】并未抑制这种活性(图1E)相反地,锌离子降低了这种活性(图1F)。这种特殊特性使我们调查了KLK7可能具备的功能,其中之一为分泌的锌敏感糜蛋白酶类丝氨酸蛋白酶(Debela等人,2007年)。
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图1 星型细胞瘤细胞系条件培养基中的Aβ降解活性药理分析
1.Aβ在CCF‐STTG1和U87细胞条件培养基中的降解活性。介质使用7PA2细胞条件培养基潜伏24小时。混合物中剩余的Aβ通过免疫印迹法直观化。24小时后,7PA2细胞分泌的Aβ完全消失,并且通过添加完整的蛋白酶抑制剂混合物对其进行抑制。
2.添加二异丙基氟磷酸盐或完整的蛋白酶抑制剂混合物使Aβ任然处于混合培养基中。异丙氟磷、二异丙基氟磷酸盐;PR、膦酰二肽;季戊四醇磷酸酯和胃蛋白酶抑制剂A。
3.甲苯磺酰基- L -赖氨酰基-氯甲烷盐酸化物或甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮对CCF‐STTG1 细胞条件培养基中Aβ降解活性的影响。甲苯磺酰赖氨酸氯甲基酮、甲苯磺酰基- L -赖氨酰基-氯甲烷盐酸化物;甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮。
4.金属蛋白酶抑制剂基质和GM6001对CCF‐STTG1 细胞条件培养基中Aβ降解活性的影响。
5.已知Aβ降解丝氨酸蛋白酶抑制剂对CCF‐STTG1 细胞条件培养基中Aβ降解活性的影响。AcMet、乙酰蛋氨酸;αplasmin、α2‐抗纤维蛋白溶酶。
6.锌离子对CCF‐STTG1 细胞条件培养基中Aβ降解活性的影响。
报道称KLK7能够打通体外Aβ小纤维的输水核心结构(Shropshire等人,2014年)。阿尔兹海默病患者的脑脊液和大脑中的KLK7表达水平下降(Diamandis等人,2004年;Bossers等人,2010年)。但是,目前尚不明确KLK7是否参与活有机体内的大脑淀粉样病变。我们确认KLK7?信使核糖核酸在日本阿尔兹海默病患者的大脑中降低50%左右(图2)(Miyashita等人,2014年),这与布拉克神经元纤维缠结阶段密切相关(附录图S2)。此外,我们分析了人体KLK7信使核糖核酸在AMP‐AD知识门户中储存的两种公共RNAseq数据集中的表达水平:Mayo RNAseq(MayoRNAseq)(Allen等人,2016年)和西奈山脑库(MSBB)AD组群。在Mayo样本集中,阿尔兹海默病患者颞叶皮层中的KLK7?抑制大幅降低(错误发现率(FDR)<0.05,β=?0.623)。同样地,与淀粉样蛋白斑块负荷增加相关的KLK7表达在西奈山脑库样本集中大幅降低(布洛德曼(BM)分区22的错误发现率<0.01,BM36的错误发现率<0.05)。
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图2:阿尔茨海默病患者大脑中的KLK7mRNA表达分析
箱形图和盒须图显示对照(Ctrl)受试者(n=24)和阿尔茨海默病患者(n=29)人体解剖大脑样本中KLK7的相对mRNA表达水平。箱形图显示中位数(中间实线)±25%。盒须图显示分别低于1.5倍四分位差25%或高于1.5倍四分位差75%的范围内的最小值或最大值。KLK7mRNA (Hs01012730_g1, Hs00192503_m1, Hs01012731_m1)的不同TaqMan探针用于qRT–PCR分析。GUSBmRNA水平(TaqMan探针Hs99999908_m1)标准化KLK7mRNA的相对表达,展示了AD患者和对照受试者之间可比较的表达情况。曼-惠特尼U检验对对照受试者和阿尔茨海默病患者进行数据分析。***P<0.001。
为测试KLK7是否与Aβ降解有关,我们检查了特定的KLK7中和抗体(MAB2624)(Bin等人,2011年)。添加MAB2624明显减少了CCF‐STTG1细胞的Aβ降解活性(图3A和B,附录图S3A)。而且,COS‐1细胞中的条件培养液过量表达KLK7,表明降解活性抑制天然分泌的Aβ(图3C和附录图S3B),而增加MAB2624摧毁了降解活性的这一特点。最后,重组净化的人类KLK7共同温育(非KLK6)源自哺乳动物细胞或有源自7PA2的Aβ或合成Aβ的细胞,导致试管内重大Aβ降解(图3D和附录图S3C-E),表明KLK7与Aβ降解直接相关。KLK7降解合成的Aβ小纤维(图3E),与先前结果一致(Shropshire等人,2014年)。为进一步说明KLK7在小鼠星形胶质细胞中的作用,我们分析了从新生大鼠中取得的原代神经胶质细胞。这一培养过程主要由原代星形胶质细胞组成,但同样包括原代小神经胶质细胞。特别是,只在Aldh1L1阳性原代星形胶质细胞中发现了Klk7阳性点,并未在Iba‐1阳性小神经胶质细胞中发现Klk7阳性点(附录图S4A)。原代神经胶质细胞培养而成的条件培养液同样表明受KLK7中和抗体抑制的独立于糜蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的Aβ降解活性(图4A和B,附录图S4B)。其他蛋白酶可能同样与Aβ降解有关,因为MAB2624在本次试验中表现部分抑制情况。这些结果表明独立于Klk7的Aβ降解活性与星形胶质细胞有关。

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图3:KLK7与Aβ降解活性有关
1.使用MAB2624(KLK7‐中和抗体)抑制CCF‐STTG1细胞的Aβ降解活性。印迹下是相对剩余Aβ40和Aβ42在正常培养液和条件培养液混合液中的量化情况(n=3,平均值±平均数标准误差,根据t检验, *P<0.05)。
2.使用MAB2624进行CCF‐STTG1细胞Aβ降解活性的剂量相关性抑制。印迹下是相对剩余Aβ40在正常培养液和条件培养液混合液中的量化情况(n=3,平均值±平均数标准误差,根据图基检验,**P<0.01)。
3.Aβ降解活性在COS‐1细胞条件培养液中表达人类KLK7。印迹下是相对剩余Aβ40在正常培养液和条件培养液混合液中的量化情况(n=3,平均值±平均数标准误差,根据图基检验,***P<0.001)。
4.重组KLK7蛋白的Aβ降解活性。文中列出了对7PA细胞的正常培养液和条件培养液混合液中剩余Aβ以及重组人类KLK7和KLK6蛋白进行的免疫印迹分析
5.通过净化的MBP示踪的hKLK7蛋白对预成型Aβ小纤维进行试管内降解。硫代黄素T荧光性测量Aβ小纤维的数量,在每个时间点显示相对荧光水平(n=3,平均值±平均数标准误差,根据图基检验,*P<0.05, **P<0.01)。
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图4:Klk7与原代星形胶质细胞条件培养液中的Aβ降解活性有关
1.原代星形胶质细胞条件培养液中的Aβ降解活性。需要注意的是,二异丙基氟磷酸和甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)抑制降解活性的方式与CCF‐STTG1细胞条件培养基中观察到的抑制方式类似。DIFP——二异丙基氟磷酸;TLCK——n-甲苯磺酰-l-赖氨酰-氯甲基酮;TPCK——甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮。
2. KLK7中和抗体MAB2624对原代星形胶质细胞的Aβ降解活性的影响。印迹下是相对剩余Aβ40和Aβ42在正常培养液和条件培养液混合液中的量化情况(n=3,平均值±平均数标准误差,根据t检验,**P<0.01)。
大脑Aβ病理学中KLK7的重要性
之后,我们使用带Klk7tm1(KOMP)VlcgVelociGene删除等位基因的胚胎干细胞培养了一群纯合Klk7基因剔除小鼠(Klk7?/?)。Klk7?/?小鼠表现正常,生育能力良好,完全摧毁了他们的Klk7mRNA表达(附录图S5A–C)。并且,MAB2624 未能抑制从Klk7?/?小鼠中获得的原代精神胶质培养液的条件培养液中的Aβ降解,表明MAB2624在降解试验中明显抑制KLK7蛋白的蛋白水解活性(附录图S5D)。然而,商业化抗体未能发现使用免疫印迹的内源性大脑KLK7蛋白。之后,我们分析了内源性鼠类大脑中的Aβ水平,发现Aβ水平在雄性和雌性Klk7?/?小鼠大脑中呈1.4倍到两倍的增长(附录图S5E)。未观察到APP、APP蛋白水解片段、ADAM10、BACE1、γ分泌酶复合物、ApoE、脑啡肽酶、胰岛素降解酶或基质金属蛋白酶9表达水平的变化(附录图S5F)。将重组KLK7蛋白注入野生小鼠的海马体中明显地减少了小鼠大脑中的Aβ水平,这一现象支持Klk7 从生理方面参与大脑Aβ分解代谢的理念(附录图S5G)。之后,我们在没有Klk7的情况下检查了App基因敲入小鼠的淀粉样蛋白病理形态(Saito等人,2014年,2016年)。纯合AppNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠在1-2个月大时出现皮质淀粉样蛋白沉积,在6-7个月大时出现被胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞包围的硫黄素S阳性斑块。由于在夹心式酶联免疫吸附测定中基因敲入等位基因中的北极突变促进聚合(Nilsberth等人,2001年)并减少免疫反应活性(Saito等人,2014年),我们使用免疫印迹法比较了大脑Aβ水平(图5A-C和附录图S6A-C)。在不影响APP和相关蛋白的情况下,删除基因Klk7?,我们观察到3个月大的AppNL‐G‐F/NL‐G‐F 小鼠大脑中添加可溶性三羟甲基氨基甲烷缓冲剂的大脑Aβ水平明显增加(附录图S7A)。并且,不可溶的Aβ(如,可溶性SDS和可溶性甲酸)数量同样增加了。appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7?/?小鼠大脑中的淀粉样沉积物同样大幅度增加了(5.6倍),与生化分析结果一致(图5D和E)。这些数据表明Klk7损失的重大影响,这些影响不仅表现在生化Aβ经济,而且表现在Aβ斑块的沉积规律上。
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图5 Klk7基因缺陷增加了appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠的大脑Aβ水平和淀粉样病变
●A–C 在3月龄appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7-1雄性小鼠大脑中的Tris缓冲液可溶性(A)、SDS可溶性(B)和甲酸可溶性(C)组分中对人类Aβ进行生物化学分析。箭头表示总Aβ。附录图S6显示了Aβ相对水平的定量。
●D. 利用82E1抗体(红色)对3月龄appNL‐G‐F/NL‐G‐F;Klk7-1雄性小鼠大脑进行免疫组织化学分析。放大的图像如下所示。比例尺:100微米。D。
● E. 显示了皮质82E1阳性总Aβ斑块(左)和皮质硫代黄素S阳性Aβ斑块(右)的定量结果(学生测试结果:n = 3或4,平均值±sem,*** P <0.001)。
我们进一步分析了与Aβ沉积有关的病理变化。我们观察到小鼠内源性tau(附录图S8A和B)的加速磷酸化以及appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7-1小鼠大脑中确定新基点1累积营养不良性神经突(附录图S8C)的形成(Kandalepas等,2013年)。此外,在同基因小鼠中检测到增加的硫代黄素S阳性淀粉样斑块(图5E)以及斑块周围的GFAP阳性胶质增生(附录图S8D),这一发现为我们的观点提供支持性依据,即淀粉样蛋白诱导的神经炎/星形细胞变化在同基因小鼠中扩张。值得注意的是,虽然GFAP的表达显着增加,但Aldh1L1水平不受Klk7基因消融的影响,表明存在激活而星形胶质细胞数量无变化(附录图7B)。总之,这些结果表明Klk7是大脑Aβ经济的关键组分,并减弱AD模型小鼠中的大脑淀粉样蛋白病理学。
Aβ处理和美金刚胺激活Klk7表达
KLK7是激肽释放酶相关肽酶级联中的末端蛋白酶,并且由KLK5介导的前结构域去除直接激活(Sotiropoulou等人,2009年)。重要的是,内源性KLK抑制剂丝氨酸肽酶抑制剂Kazal类型5(SPINK5)缺失导致的KLK5和KLK7活性上调导致特应性皮炎相关的疾病,包括Netherton综合征(Furio&Hovnanian,2014年)。然而,Klk7 mRNA表达通过皮肤中的细胞因子选择性调节(Morizane等,2012年),表明Klk7 mRNA的转录受特定机制的控制。事实上,Klk7 mRNA表达在appNL‐G‐F/NL‐G‐Fmice中显着且选择性地增加(图6A)。此外,Klk7而不是其他Aβ降解酶(即基质金属蛋白酶、中性溶酶和胰岛素降解酶)的mRNA表达以年龄依赖性方式进一步特异性增强(图6B和附录图S9)。有趣的是,用Aβ42而不是脂多糖处理原代星形胶质细胞显着增加Klk7的表达(图6C和D)。虽然我们不能排除脂多糖在Klk7中可能具有一定的调节作用,但这些结果表明Klk7转录通过星形胶质细胞中的Aβ选择性调节,并且可能选择性增加Klk7表达。
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图6星形胶质细胞中Aβ对Klk7表达的上调
1.5月龄雄性appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠大脑中Klk5、Klk6、Klk7和Spink5 mRNA的相对水平(学生测试结果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P<0.01)。
2.5月龄和13月龄雄性appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠的Klk7 mRNA水平(学生测试结果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P <0.01)。
3. Aβ肽对从野生型小鼠获得的原代星形胶质细胞中Klk7 mRNA表达的影响(学生测试结果:n = 6,平均值±s.e.m.,* P <0.05)。
4. 1微克/毫升脂多糖对从野生型小鼠获得的原代星形胶质细胞中Klk7 mRNA表达的影响(学生测试结果:n = 6,平均值±s.e.m.,* P <0.05)。
我们最近研究了美金刚胺(美国食品和药物管理局批准的抗痴呆药物和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂)对原代培养物中Aβ代谢的影响(Ito等人,2017年)。我们注意到,美金刚胺治疗仅在原代神经元和神经胶质共培养的条件培养液中显着减少了加入标准的人类Aβ,但是在原代神经元培养物的条件培养液中未显着减少加入标准的人类Aβ(图7A和B)。另外,我们以及其他人已经发现,美金刚胺Tg2576 app转基因小鼠的慢性治疗降低了Aβ水平(Dong等人,2008年;Ito等人,2017年)。因此,我们假设美金刚胺会影响星形胶质细胞中的Klk7mRNA表达和大脑中的Aβ沉积。美金刚胺处理的Tg2576小鼠脑中的Klk7mRNA水平特异性上调(图7C),其也支持这一观点。此外,美金刚胺增加主要星形胶质细胞中的Klk7 mRNA。然而,N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂MK-801未能在原代星形胶质细胞中诱导Klk7mRNA(图7D)。有趣的是,谷氨酸以及N-甲基-D-天冬氨酸处理显着降低了Klk7 mRNA水平,表明MK-801不敏感的星形细胞谷氨酸信号传导可能涉及Klk7表达的调节(图7E)。我们还发现,从美金刚胺处理的原代星形胶质细胞中获得的条件培养液显着增强了Aβ降解效率(附录图S10)。这种效应在来自Klk7淘汰小鼠的星形胶质细胞中消除(图7F)。这些数据表明星形细胞Klk7表达通过小鼠脑中的Aβ调节,并且由美金刚胺选择性地上调。
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图7美金刚胺对Klk7依赖性Aβ降解活性的影响
●A, B美金刚胺在人类Aβ加标实验中的作用。在DIV8用或不用30微米美金刚胺(Mem)处理原代神经元培养物或神经元和神经胶质共培养物。将30微米的合成人类Aβ42肽掺入这些培养物中。(B)显示了通过人类Aβ特异性夹层酶免疫吸附测定法体外测定几天内剩余人类Aβ42的水平(学生测试结果:n = 6,平均值±s.e.m.,*** P <0.001)。
●C. 美金刚胺(Mem)治疗的雌性Tg2576小鼠脑中Klk5、Klk6、Klk7和Spink5 mRNA的相对水平(学生测试结果:n = 5或4,平均值±s.e.m.,* P <0.05)
●D. 30微米美金刚胺或10微米MK-801对野生型小鼠原代星形胶质细胞中的Klk7 mRNA表达的影响(Tukey测试结果:n = 5或6,平均±s.e.m.,** P <0.01)。
●E. 20微米谷氨酸或50微米N-甲基-d-天冬氨酸对野生型小鼠原代星形胶质细胞中Klk7 mRNA表达的影响(Tukey测试结果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P <0.001)。
● F. 30微米美金刚胺对野生型或Klk7?/?小鼠原代星形胶质细胞的条件培养液中Aβ降解活性的影响。对剩余的Aβ40和Aβ42进行定量(学生测试结果:n = 4,平均值±s.e.m.,* P <0.05,** P <0.01)。
讨 论
在这项研究中,我们确定KLK7是大脑Aβ经济调节中重要星形细胞的关键组分。我们观察到Klk7?/?小鼠大脑中内源性Aβ水平增加1.4倍至两倍,这几乎与体内脑啡肽酶或胰岛素降解酶基因缺失的影响相当(Saido&Leissring,2012年)。此外,Klk7缺失增加AD模型小鼠中硫代黄素S-阳性淀粉样蛋白沉积。因此,KLK7是关键的Aβ降解酶之一,这表明星形胶质细胞参与调节通过Klk7途径的Aβ发病机制。据报道,KLK7能够切割Aβ原纤维的疏水核心基序并在体外降低细胞毒性(Shropshire等,2014年)。与此结果一致,我们发现appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠表现出加速的神经炎变化和炎症反应(即增加的tau磷酸化、营养不良性神经突和反应性星形胶质细胞)。然而,我们没有观察到大脑中神经元数量和同类小鼠行为的显着变化,这可能是由于模型小鼠的年龄较小。尽管如此,尚不清楚大脑中KLK7上调是否通过降解其他底物引起有害作用。通过蛋白质组学方法了解大脑中KLK7的生理功能和底物很重要(Yu等人,2015年)。
Aβ处理选择性诱导体外Klk7的表达,并且Klk7表达与AD模型小鼠中的Aβ沉积相关。Aβ上调KLK7 mRNA的分子机制尚不清楚。然而,KLK7与皮肤炎症有关(Furio&Hovnanian,2014年;Prassas等,2015年)。有趣的是,抗炎Th2细胞因子,如白介素-4和白细胞介素-13,增加人类角质形成细胞中KLK7 mRNA的表达(Morizane等,2012年)。这些数据表明Klk7表达通过星形胶质细胞中受Aβ诱导的炎症反应进行自我平衡调节。值得注意的是,也增加了反应星形胶质细胞中其他Aβ降解酶、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达(Yin等人,2006年),尽管不溶性Aβ的水平在Mmp2或Mmp9淘汰小鼠大脑中未受影响,这也表明KLK7在清除体内聚集的Aβ低聚体形式中起主要作用。然而,调节星形胶质细胞中星形胶质细胞反应以增加KLK7表达将是一种新的减少Aβ沉积的治疗方法(De Strooper&Karran,2016年)。
然而,与模型小鼠相反,我们发现在脑中具有显着Aβ沉积的AD患者中KLK7 mRNA显着降低。重要的是,AD模型小鼠不反映人类AD大脑的所有特征(例如缠结和主要神经元丢失的形成)。因此,这些病理变化可能会影响KLK7 mRNA的表达。此外,纵向研究显示Aβ沉积在临床症状出现之前开始10至15年(De Strooper&Karran,2016年)。因此,其他可能性为:Aβ沉积引起的延长炎症反应可能改变星形胶质细胞的表型以减少人脑中的KLK7表达,虽然这种病理表型的机制尚不清楚。值得注意的是,KLK7 mRNA的表达通过癌细胞系中组蛋白的甲基化调控(Raju等人,2016年)。分析AD大脑中KLK7的表观遗传调节和/或星形胶质细胞的活化状态非常重要。
本研究最重要的发现是美金刚胺体外和体内治疗增加了Klk7表达。美金刚胺在联合疗法方面具有很大的潜力,有助于促进淀粉样蛋白的清除,例如除免疫疗法或甚至作为通过免疫疗法成功去除淀粉样蛋白后的单一疗法。获得对美金刚胺诱导的选择性Klk7的机理认识将为开发星形胶质细胞靶向AD治疗做好铺垫。值得注意的是,正确的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂MK-801未能影响Klk7 mRNA的表达,而谷氨酸以及N-甲基-D-天冬氨酸降低了Klk7的水平。这一结果表明,星形胶质细胞中的N-甲基-D-天冬氨酸受体对这些拮抗剂与神经元中的拮抗剂有不同的反应。事实上,已经强调了不同于神经元中神经胶质N-甲基-D-天冬氨酸受体的异常亚单位组成(Dzamba等人,2013年),这提高了MK-801不敏感新型星形细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体参与Klk7表达调节的可能性。有趣的是,无论传统的N-甲基-D-天冬氨酸受体表达如何,美金刚胺诱导了T细胞中Th2细胞因子的表达(Kahlfuss等人,2014年)。因此,美金刚胺可能调节星形胶质细胞中的抗炎细胞因子信号传导以通过新机制增加Klk7表达。重要的是,美金刚胺对皮肤的显着不良反应尚未报道,这表明美金刚胺治疗不足以引起KLK7过度激活导致的皮肤疾病表型(Hansson等人,2002年)。然而,了解KLK7介导Aβ降解在分子水平的调节机制应提供对星形胶质细胞的病理作用以及其作为针对AD治疗靶标可能性的新见解。(生物谷Bioon.com) 温馨提示:87%用户都在生物谷APP上阅读,扫描立刻下载! 天天精彩!
激肽释放酶相关肽酶7损失加剧阿尔茨海默病模型小鼠淀粉样病变
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