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实习医生日记之顽固失眠

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实习医生日记之—妊娠剧吐

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实习医生日记之猪蹄脚

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肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

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摘要:第一次利用两个技术独立的商业化荧光免疫组织化学分析平台在个乳腺癌案例中分析与乳腺癌复发存在线性关系实验结果可以作为今后其他平台的检测基准以及为病理学实验室的操作人员提供客观的肿瘤定量标记物这篇文章于年月发表于杂志上

第一次利用两个技术独立的商业化荧光免疫组织化学分析平台,在382个乳腺癌案例中分析Nuc-Stat5与乳腺癌复发存在线性关系。实验结果可以作为今后其他平台的检测基准以及为病理学实验室的操作人员提供客观的肿瘤定量标记物。这篇文章于2016年1月发表于Modern Pathology杂志上。

经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片上的蛋白标记,一般在免疫组化染色后由病理学家通过视觉评估并打分。评估结果被用于肿瘤治疗方案选择以及确定新的预后和预测生物标志。但是由于视觉观察免疫评分的限制性,一些新的免疫组化标记物无法被用于临床应用。原因在于病理学家主观评价肿瘤标志物基于免疫组化染色的密度,提供不连续的、定性而非定量的数据,而且结果受不同观察者的影响。相对于人眼,数码病理平台的分辨率较高,具有更宽的动态范围,不受主观及肉眼视觉错觉的限制,通过计算机协助的影像分析可以提供连续的可供定量的免疫组化数值。有些平台经FDA批准可以用于临床诊断乳腺癌,有些平台可以利用多通道的荧光免疫组化检测组织区域以确定亚细胞成分。可以通过特异性标志物的分子共存自动获得特殊区域的强度得分。

基于免疫荧光图像的蛋白表达定量代表到了一种优越的替代方案,优于基于染色的生物标记定量。其优点在于可以产生更多的动态信号区域,可以加强多通道染色,其对抗体的高敏感性意味着可以应用更低的抗体浓度、更短的孵育时间,以及更少的非特异性染色。在对乳腺癌β-catenin与 Her2的研究以及 AMACR前列腺癌研究中有文献报道,定量荧光免疫组化分析平台可以确定不被人眼辨识的携带免疫标签的细胞。

经过10-15年的发展,现有的各种软硬件平台各具特色。但正因如此,很难确定客观定量的免疫组化数据的有效性,尤其是其测量基准与免疫组化染色结果相冲突的时候。在缺乏建立定量免疫组化定量数据金标准的情况下,如果两个独立的多色免疫荧光分析平台同时支持供应商选厂的提供客观和定量的免疫组化数据,那么对肿瘤研究预后标志物的免疫组化数值应该高度一致并产生与临床预测结果相比较的分析结果。

我们之前利用过PM2000影像系统(HistoRx/Genoptix)与AQUA影像软件(HistoRx/Genoptix)对多色的蛋白标记物免疫组化数据进行过分析。可供替代的荧光免疫组化平台联合ScanScopeFL (Aperio/Leica Biosystems)进行影像捕捉与Tissue Studio (Definiens)进行影像分析。通过对细胞核定位水平、对酪氨酸磷酸化的Stat5a/b (Nuc-pYStat5)在乳腺癌组织中的微阵列组进行比较,在两个独立的荧光免疫组化平台上经线性矫正后得出了高度一致的Nuc-pYStat5水平数值,客观独立确定了Nuc-pYStat5乳腺癌患者亚群的复发风险。更重要的是,在每个平台建立的数据切割点(data-driven cutpoint)都可以成功移植到其他平台上。新结论与之前利用PM2000/AQUA平台研究的关于抗雌激素治疗可以增加携带Nuc-pYStat5标记乳腺癌患者亚群的发病风险的结果相一致。

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

图 1 使用两平台对323例乳腺癌患者细胞核pYStat5荧光免疫组化结果进行捕捉与定量。

分析:PM2000影像捕捉/AQUA软件分析(PM2000/AQUA)与ScanScopeFL影像捕捉/TissueStudio软件分析(ScanScopeFL/TissueStudio)结果高度一致。结果对数值用散点图表示,Bland-Altman区分与均值回归建立线性标定方程。粗线为从TissueStudio到AQUA的对数变换值转换公式,细线代表95%的可信区间。两个荧光免疫组化分析结果显示在线性矫正后惊人的一致。

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

图 2 AQUA和Tissue Studio量化并通过数据区分细胞核pYStat5水平可再生的确定了细胞核携带pYStat5标记的低肿瘤水平的雌激素受体阳性患者增加疾病的再发风险。

分析:使用PM2000/AQUA与 ScanScopeFL/TissueStudio平台对193例雌激素受体阳性乳腺癌样本中Nuc-pYStat5免疫组化定量。两个平台通过数据化的切割点分为低免疫组化检测Nuc-pYStat5 (Nuc-pYStat5 IFlow)与高免疫组化检测Nuc-pYStat5 (Nuc-pYStat5 IFhigh)的数据来自PM2000/AQUA(a)或ScanScopeFL/TissueStudio(c),每个平台使用Kaplan–Meier分析非复发的生存率。两个平台确定了相似的细胞亚群,其患者肿瘤显示低Nuc-pYStat5 (≈20%)增加了复发的风险。PM2000/AQUA上源于数据的光学切割点线性校准由ScanScopeFL/TissueStudio数据,使用公式ScanScopeFL/TissueStudio = 0.43+0.95 × PM2000/AQUA(b);ScanScopeFL/TissueStudio上源于数据的光学切割点线性校准由PM2000/AQUA数据,使用公式PM2000/AQUA = ? 0.45+1.06 × ScanScopeFL/TissueStudio(d)。来自第一个平台的校准切割点被应用于第二个平台并进行Kaplan–Meier分析(b和d)。

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

表格 1:雌激素受体阳性乳腺癌患者按Nuc-pYStat5高、低分类(通过特定平台的数据源性割点和线性校准割点)

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

表格 2使用PM2000/AQUA与 ScanScopeFL/TissueStudio平台对Nuc-pYStat5免疫荧光染色多元化分析

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

图 3  AQUA和Tissue Studio 对细胞核pYStat5水平分析

分析:AQUA和Tissue Studio 对细胞核pYStat5水平分析结果与基于连续标记水平的临床预测结果高度一致。在193例雌激素受体阳性乳腺癌患者使用PM2000/AQUA与 ScanScopeFL/TissueStudio平台分析,两个平台使用receiver-operating曲线计算5年(a)与10年(b)的无复发生存率。相似的结果与1-12年观察的生存曲线相似。重叠区域之下的receiver-operating曲线(c)。

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

图 4 在193例雌激素受体阳性的乳腺癌肿瘤中,与病理学家对标准免疫组化染色打分相比较。

分析:增长的动态范围为pYStat5在乳腺癌中表达提供了一个新的数据信息。(a)病理学家判断染色阳性(DABhigh) 与阴性 (DABlow)作为判断≥1%的免疫反应细胞核,在ER阳性乳腺癌患者的Kaplan–Meie分析中并不能确定Nuc-pYStat5作为一个肿瘤复发的标记物。(b)病人按基于高/低Nuc-pYStat5肿瘤情况的荧光免疫组化结果(IFhigh,IFlow)与基于阳性/阴性Nuc-pYStat5肿瘤情况的DAB染色结果(DABhigh, DABlow)被分为3组,进行时间分析。高分辨率与高敏感性荧光免疫组化允许对低Nuc-pYStat5表达肿瘤的升高复发风险进行评估。

肿瘤蛋白标记定量的有效性被两个独立的自动化免疫荧光图像分析平台确认

图 5  两个独立操作者的操作比较

分析:两个独立操作者利用Tissue Studio分析在乳腺癌中Nuc-pYStat5荧光免疫组化分析。(a)两个操作者(ARP与HR)遵循相同的Tissue Studio分析操作标准,对336例乳腺癌样本的组织微阵列格式进行分析。在12个样本中独立选择肿瘤组织并建立指南。操作者一致性分析显示高一致性关联系数0.993(95%可信区间:0.991,0.994)(b)另一个操作者一致性分析显示高一致性关联系数0.996(95%可信区间:0.995,0.997)在同一个操作者(ARP)使用Tissue Studio重复分析。实线证明其高度一致。

从两个不同图像分析技术平台获得的高度整合的数据,可以作为今后其他平台的检测基准以及为病理学实验室的操作人员提供客观的肿瘤定量标记物。将极大的增强我们在药物研发以及癌症个体化疗法上所作出的努力。(生物谷Bioon.com)

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